Иммуноферментный анализ крови – одно из важнейших исследований, проводимых для оценки способности организма человека противостоять атаке болезнетворных микроорганизмов. Оно позволяет понять, насколько хорошо иммунная система справляется с инфекционными процессами. Это, в свою очередь, дает возможность скорректировать схему лечения, если таковое проводится.
И это еще далеко не все особенности данного теста, поэтому давайте подробно рассмотрим вопросы, что такое ИФА анализ, кому он показан, как он выполняется, и о чем могут говорить полученные данные.
Что это за исследование
Итак, что это такое – ИФА анализ? Расшифровывается данная аббревиатура как «иммуноферментный анализ». Проводится он в том случае, если необходимо определить наличие антител к разного рода антигенам.
Антигенами называются болезнетворные агенты, способствующие развитию различных патологий. Антитела – вещества, которые необходимы для уничтожения чужеродных клеток.
Иммуноанализ крови направлен на определение уровней иммуноглобулинов, которые могут объединяться в иммунокомплексы. Они активно вырабатываются иммунной системой в ответ на внедрение в организм антигенов.
Примечание. Для борьбы с каждым отдельным видом антигена вырабатываются свои специфические антитела. Именно это помогает выявить болезнь, и даже ее стадию, с помощью иммуноферментного исследования крови.
При проникновении чужеродного антигена в организм человека антитела «связываются» с ним, после чего нейтрализуют его воздействие. Происходит это за счет ферментативного лизиса и реакций фагоцитоза. Благодаря такому процессу антигены выводятся из крови.
Когда назначается тест?
Разобравшись в том, что такое иммуноферментный анализ, разберемся в ситуациях, при которых показано его проведение. Так, исследование необходимо при:
- онкологических заболеваниях;
- вирусных гепатитах;
- герпетических высыпаниях на коже или слизистых оболочках;
- сальмонеллезе;
- кори;
- энцефалите;
- сифилисе;
- дизентерии;
- атопических дерматитах или нетипичных проявлениях аллергических реакций.
Помимо этого, метод ИФА применяется для определения и выявления возбудителей:
- заболеваний, передающихся половым путем;
- цитомегаловирусной инфекции;
- гельминтозов.
Иммуноферментный анализ – это исследование, помогающее определить природу эндокринных заболеваний, а также выявить наличие иммунодефицита и бесплодия у мужчин и женщин. С его помощью составляются прогнозы дальнейшего течения инфарктов, инсультов, неврологических и почечных заболеваний.
Проводится ИФА анализ и в профилактических целях. Обязательно его выполняют при беременности, а также пациентам, ранее перенесшим вышеописанные заболевания. Лица, входящие в группу риска развития ранее упомянутых болезней тоже регулярно сдают кровь на ИФА.
Особенности проведения теста и расшифровка
В большинстве случаев для иммуноферментного исследования берется кровь больного. Но при определенных обстоятельствах может осуществляться забор тканей с поверхности стекловидного тела. У беременных женщин ИФА диагностика может проводиться посредством изучения состава околоплодных вод.
Забор крови выполняется с использованием шприца, при этом материал для исследования берут, как правило, из вены, походящей на внутренней стороне локтевого сгиба. Пациент при этом должен находиться в расслабленном состоянии, в положении сидя.
Важно! Результаты теста, его и расшифровка данных зависит от методики проведения диагностической манипуляции, и используемого при этом оборудования. Как правило, каждая лаборатория указывает на бланке нормы показателей иммуноглобулинов.
Особенности подготовки
Анализ крови на ИФА требует выполнения определенных подготовительных процедур:
- отказа от завтрака в день теста;
- прекращения приема препаратов, разжижающих кровь, и других фармакологических средств, способных повлиять на результаты (после предварительной консультации у лечащего врача);
- воздержания от курения в день исследования;
- отказа от употребления спиртного за день до забора крови;
- исключения приема наркотических веществ (в том числе, и медпрепаратов, которые их содержат).
Соблюдение таких правил подготовки к иммунохимическому анализу крови исключает возможность искажения данных.
Трактовка данных
Результаты исследования выдаются пациенту на руки, после чего он проходит повторную консультацию у специалиста. Расшифровка данных ИФА может быть положительной или отрицательной. При этом в расчет также принимаются цифры, обозначающие (если таковые были обнаружены).
Если ИФА отрицательный, это может говорить об отсутствии патологических процессов, либо о начальной фазе их развития. Также «минусовый» результат исследования наблюдается при выздоровлении пациента после пройденного курса терапии. Но подобные данные можно получить только по истечении определенного промежутка времени (1 – 2 месяцев).
Если и IgM в крови отсутствуют, а анализ ИФ показал положительный результат на , это может свидетельствовать о том, что у пациента сформировался стойкий иммунитет к определенному виду антигенов. Подобное происходит при иммунизации.
При высокой концентрации IgM на фоне отсутствия IgG и IgA речь может идти о воспалительном процессе, протекающем в острой фазе.
Что означает, если ИФА положительный для всех видов иммуноглобулинов? В подобных случаях речь может идти о рецидиве инфекционной патологии. При этом возникновение антител фиксируется только при острой фазе хронической болезни.
При переходе заболевания в фазу затухания будут отрицательными. А вот ИФА на IgG и IgA будет положительным.
Плюсы и минусы теста
Исследование крови методом ИФА имеет свои сильные и слабые стороны. К плюсам можно отнести:
- относительно невысокую стоимость;
- точность;
- возможность регулярного проведения с целью оценки эффективности проводимого лечения;
- быстроту выполнения;
- использование высокоточных и высокоинформативных технологий для получения достоверных результатов;
- возможность проведения множественных исследований в области одного и того же очага патологического процесса;
- абсолютную безболезненность;
- отсутствие любых рисков для здоровья пациента;
- относительную простоту исследования.
Исследование крови ИФА, благодаря вышеописанным преимуществам, приобрело широкую распространенность, и играет немаловажную роль в диагностике различных заболеваний.
Недостатки
Существенным минусом ИФА крови является вероятность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Но это связано в большинстве случаев не с самим методом исследования, а с человеческим фактором.
Еще один нюанс, способный повлиять на конечные данные, - применяемые в ходе теста медикаментозные препараты. При их неправильном использовании, либо же в случае брака, расшифровка анализов ИФА будет недостоверной. Следовательно, исследование придется проводить повторно.
Важно! Повлиять на данные теста может нарушение обменных процессов в организме пациента. Помимо этого, на результатах может сказаться и наличие сразу нескольких очагов инфекционных (хронических!) заболеваний.
Анализ крови методом ИФА проводится для выявления:
- аскаридоза;
- описторхоза – острого или хронического;
- лямблиоза;
- токсоплазмоза.
Также при проведении исследования в организме пациента могут быть обнаружены острицы или амебы. Диагноз «лейшманиоз» и «трихинеллез» тоже нередко ставятся больным на основании данных анализа крови ИФА.
Подводим итог
Конечно, самостоятельно разобраться в данных теста очень трудно, поскольку во время этого процесса должны учитываться многочисленные факторы. Вредные привычки, наличие сопутствующих заболеваний, применение определенных групп медикаментозных препаратов – все это играет важную роль, и может повлиять на результаты, что и берется в расчет врачами при расшифровке результатов ИФА.
Однако, «осведомлен, значит, вооружен», поэтому каждому человеку важно знать особенности проведения и трактовки данных тех лабораторных исследований, которые ему назначает лечащий врач. И метод ИФА не является исключением!
Анализ ИФА (иммуноферментное исследование) - современная диагностическая процедура, направленная на выявление в крови специфических антител к возбудителям ряда заболеваний, определение стадии развития патологии и ее этиологии. Применяется как метод контроля за процессом лечения и его эффективностью. В процессе исследования анализируются качественные и количественные показатели.
Метод ИФА обладает высокой информативностью, точность результатов составляет более 96%. Диагностика доступна практически в любой лаборатории и медицинском учреждении.
Основные показания
Иммуноферментное исследование назначается с целью подтверждения наличия инфекционных заболеваний, передающихся половым путем:
- трихомониаза;
- хламидиоза;
- уреаплазмоза;
- сифилиса и др.
Также ИФА применяется для диагностики вирусных заболеваний:
- герпеса;
- герпеса 4 типа (вирус Эпштейна-Барра);
- вирусного гепатита;
- цитомегаловирусной инфекции.
Как подготовиться к исследованию
Биологическим материалом для исследования служит кровь. За несколько дней до ее сдачи исключается прием медикаментозных препаратов. За 14 дней останавливается прием антибиотиков, противогельминтных и противовирусных средств.
Забор материала осуществляется утром натощак. За час до процедуры разрешается выпить стакан воды без газа, прием пищи исключается.
Особенности анализа
Для проведения исследования берется венозная кровь, в объеме не менее 5 мл. В отдельных случаях в качестве биоматериала используется спинномозговой ликвор, амниотическая жидкость или содержимое стекловидного тела.
Забор крови осуществляется при помощи инъекционной иглы, строго натощак, с целью избежания ложноположительных результатов. За 12 часов следует отказаться от курения и приема алкогольных напитков. При употреблении наркотических веществ результаты анализа искажаются.
Если в заключении указаны отрицательные значения иммуноглобулинов G, А, М, это говорит о начальной фазе развития патологического процесса либо о его отсутствии. Такой результат регистрируется при полном выздоровлении на фоне проведенной терапии.
Отрицательный результат IgM и IgA и положительный IgG говорят о формировании иммунитета после инфекционного заболевания или вакцинации.
Положительный результат IgM и отрицательный или положительный результат IgG, IgA свидетельствуют о наличии острой инфекционной патологии.
Анализ ИФА проводится достаточно быстро, результаты готовы через сутки после забора материала.
Представляя собой современный вид лабораторного исследования, ИФА, или иммуноферментный анализ позволяет найти в крови специфические антитела либо антигены к определенным заболеваниям. Это позволяет обнаружить как этиологию болезни, так и определить ее стадию. При этом результаты подобного вида исследования могут выдаваться как количественно, так и качественно. Итак, давайте рассмотрим в подробностях принцип метода иммуноферментного анализа, его методику и суть.
Что такое иммуноферментный анализ
Назначаемый для максимально полной комплексной оценки состояния здоровья, иммуноферментный анализ позволяет оценить общее состояние здоровья и дать оценку его защитным функциям. Данное лабораторное исследование позволяет диагностировать инфекционные, аутоиммунные, гематологические патологии при анализе крови.
Суть иммуноферментного анализа рассмотрена в видео ниже:
Кому его назначают
Данное исследование может быть назначены тем больным, у которых выявляется наличие следующих заболеваний:
- болезни вирусного происхождения, к которым относятся гепатиты, ;
- заболевания, которые передаются половым путем — хламидиоз, трихомонада, сифилис, уреаплазма, микоплазма;
- иммунодефицит;
- проведение предоперационного комплексного обследования.
ИФА анализ крови назначается также для определения уровня гормонов и оценки качества проводимого вида терапии.
Врачом может быть назначен данный анализ для установки стадии имеющегося заболевания, что позволяет своевременно вносить корректировки в применяемое лечение. А высокая точность получаемых данных позволяет иметь максимально развернутую картину здоровья. При этом получение данных после проведенного исследования происходит в очень короткий промежуток времени, что позволяет отслеживать динамику развития патологического процесса.
Зачем сдавать такие анализы
Поскольку благодаря ИФА анализу крови можно получить значительное количество информации о состоянии здоровья и патологических процессах, происходящих в организме, именно он дает возможность наиболее полно учитывать исходные данные (общее состояние здоровья, стадия заболевания, динамика развития патологического процесса, показатель эффективность применяемой терапии) при составлении схемы лечения.
По этой причине для получения наиболее выраженного результата лечения и быстрейшего прекращения патологического процесса в организме назначается ИФА анализ крови. Серьезные заболевания иммунной системы, наличие антигенов в крови и причины аллергии на основе полученных данных можно вылечить более быстро, применяя наиболее результативные методы.
Назначение ИФА анализа проводится при множестве патологий, и делать его следует только по назначению врача. Частота проведения анализа также устанавливается врачом, и при сдаче крови для проведения ИФА анализа картина болезни наиболее полная. Поскольку получение динамики течения болезни возможно при сдаче данного анализа более одного раза, наиболее часто может назначаться сдача крови от трех до пяти раз. Это дает возможность сравнить количество антител в крови в различные временные промежутки.
Виды такой процедуры
Существует несколько разновидностей иммуноферментного анализа. Различаются они видом взятой жидкости из организма человека, на основании которой проводится изучение ее состава и наличия определенных антигенов.
При этом для анализа может браться не только кровь человека, но и другие его жидкости:
- околоплодные воды,
- спинномозговая жидкость,
- содержимое стекловидного тела,
- мазки,
- слизь из уретры и цервикального канала.
Проведение самой операции по взятию определенного вида жидкости стандартный и проводится в условиях дневного стационара.
Показания для проведения
Обычно ИФА анализ назначается врачом при необходимости получения развернутой картины текущего заболевания, проходящего в любой форме: хронической, вялотекущей либо острой. И показаниями к проведению данного вида анализа могут считаться следующие состояния и лечебные цели:
- поиск антигенов определенных заболеваний;
- определение гормонального статуса;
- выявление в организме вируса гепатита;
- исследование на ;
- поиск антител к любому виду инфекционного заболевания;
- обследование на наличие аутоиммунных поражений организма.
О проведении иммуноферментного анализа смотрите в видео ниже:
Противопоказания для проведения
Противопоказаний для иммуноферментного исследования на сегодняшний день не выявлено.
При беременности, когда наблюдается постоянное изменение содержания в крови гормонов, необходимо неоднократное проведение данного анализа для подтверждения полученного результата. Новорожденные и дети грудного возраста могут также иметь некорректные данные анализа: во время внутриутробного развития определенные виды антител могут проникать в кровь плода через плаценту матери. Потому их наличие во взятом анализе не следует считать признаком имеющейся инфекции.
Безопасность анализов
Проведение процедуры взятия любого вида жидкости из организма человека не приносит никакого отрицательного воздействия на организм. Полная стерильность при совершении манипуляций позволяет избежать вероятность заражения любыми видами заболеваний.
Подготовка к проведению
Для получения максимально достоверных результатов исследования следует воздержаться от употребления алкогольных напитков и наркотических препаратов перед взятием крови (либо иной жидкости) на анализ.
Как проходит процедура, ощущения во время нее
Для проведения ИФА анализа кровь у пациента берется строго натощак: следует не принимать пищу в каком-либо виде не менее чем за часов до процедуры. Анализ берется из локтевой вены.
О наличии любых заболеваний и принимаемых лекарствах сообщается врачу заранее, наиболее часто препараты на момент сдачи крови будут отменены. Ощущения во время проведения процедуры сходны со взятием крови для проведения биохимического анализа.
Расшифровка результатов
ИФА-диагностика позволяет определить наличие инфекции в организме, активность патологического процесса и этиологию имеющейся инфекции. Быстрое получение результата проведенного анализа (в течение суток) — одно из преимуществ данного вида исследования.
Процесс расшифровки полученной информации осуществляет врач. При этом следует учитывать, что корректность полученных результатов по динамике любых процессов гарантируется при прохождении анализов в одной лаборатории.
Средняя стоимость процедуры
Средняя цена ИФА-исследования зависит от направленности анализа и определения конкретных величин. Так, определение серологических маркеров инфекционных заболеваний различных видов (anti-HAV IgG, anti-HAV IgM, HBsAg) будет стоить от 200 до 320 рублей и проводится в течение 2 рабочих дней. Показатель стоимости данной процедуры считается также его преимуществом: доступность цен на любые виды исследований позволяет проводить исследование при любом размере бюджета.
Стоимость ИФА-исследования зависит от политики медицинского учреждения, однако его следует считать общедоступной процедурой, позволяющей получить развернутую картину имеющегося заболевания и обеспечить максимально полное лечение.
Про нормы и особенности ИФА-исследования смотрите в видеоролике ниже:
5.1 Сущность и классификация ИФА.
ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для индификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участие Е.Энгвалл и Р.Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р.Шурс.
Рис. 6 Основной принцип ИФА:
для выявления антигенов; 2) для выявления антител
Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 6).
Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.
Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.
Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:
+[АГ]↔[АТАГ]
Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.
Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:
1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;
2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:
1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.
А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.
Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.
2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.
Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.
В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.
При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.
Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.
Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.
3. По принципу определения тестируемого вещества:
А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.
Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.
5.2 Характеристика компонентов, используемых в ИФА.
Ферменты.
Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.
Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:
– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;
– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;
– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;
– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.
В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.
Субстраты.
Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.
Основные требования к субстрату:
– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;
– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;
– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.
Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.
Образование конъюгата.
Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.
При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.
Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.
Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.
Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 - 60 % от свободного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.
В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).
Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).
Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:
Высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;
Достаточной специфичностью в рабочем разведении;
Преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;
Оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);
Достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.
5.3 Гетерогенные методы ИФА.
Гетерогенные ИФА (или твердофазные ИФА) включают методы, в которых анализируемое соединение находится в двух фазах. Для разделения компонентов иммунохимической реакции используют твердую фазу (нерастворимый носитель, как правило, пластик) с иммобилизованными на ней антителами или антигеном, которую отмывают на каждой стадии с целью удаления промежуточных продукто непрореагировавших компонентов.
Иммобилизацию можно проводить путем ковалентного связывания антител (антигенов) с активированным носителем, используя химические подходы, а также путем физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров (например, полистирольных пластин). В зарубежной литературе это направление получило название ELISA-тест или энзимсвязанный иммуносорбентный метод (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay).
Неконкурентный ИФА определения антигенов на примере использования меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител.
К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся антигенов и добавляют меченые антитела – конъюгат. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству антигена в исследуемом образце. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата добавляют хромогенный субстрат для используемого фермента, который изменяет цвет под действием фермента, т. е. происходит ферментативная реакция с окрашиванием раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству меченых ферментом специфических антител, фермента и, соответственно, исследуемого антигена. Измерения оптической плотности раствора в лунках при определенной волне (в зависимости от используемого субстрата) проводят с помощью специальных спектрофотометров, адаптированных для микропланшетов – ридеров. Количественную оценку концентрации антигена в пробе определяют, сравнивая результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного раствора антигена.
Рисунок 7.
Поскольку на стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается связанным с молекулами иммобилизованных и меченых антител, в литературе этот метод часто называют «сэндвич»-метод (от англ. sandvich) или двухцентровый метод ИФА (от англ. two-site assay).
Этот метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых имеется, по крайней мере, две антигенные детерминанты. Для анализа большого количества моновалентных антигенов (лекарственных соединений, пестицидов и др.) он неприемлем.
Основное достоинство данного метода – высокая чувствительность. Предел обнаружения соединений данным методом в настоящее время достигает величины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600 молекул анализируемого вещества. Максимальная чувствительность достигается при проведении каждой иммунологической реакции в равновесном режиме, что сказывается на длительности проведения анализа, которая в среднем составляет 4 – 6 часов. Неконкурентный ИФА определения антител на примере использования меченых ферментом вторичных антител и иммобилизованных антигенов.
К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и отмывания от несвязавшихся антител добавляют меченые вторичные антитела, которые специфичны к анализируемым антителам. После вторичной инкубации и удаления избытка меченых вторичных антител содержание ферментной метки на носителе пропорционально концентрации специфических антител в сыворотки.
Данная схема является одной из наиболее распространенных ИФА определения антител, поскольку позволяет выявлять антитела к разным антигенам.
Гетерогенный конкурентный ИФА определения антигена на примере использования меченого антигена и иммобилизованных антител.
К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.
5.4 Гомогенный метод ИФА.
Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) - наиболее простой в методическом отношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом и за ходом формирования комплекса антиген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.
Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного разобщения фермента и субстрата, либо за счет конформационных изменений в молекуле фермента, сопровождающих формирование иммунного комплекса. ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью ГИФА, занимает минуты и даже доли минут).
Рис. 8 Варианты гомогенного иммуноферментного анализа (А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело).
Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких и требующих времени этапов промывки. И наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8-50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Однако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток - на его основе можно создавать диагностические тест-системы только для низкомолекулярных антигенов. Только, в этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, (несмотря на кажущуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на основе ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекулярных белков.
5.5 «Сэндвич» - вариант ИФА для выявления антигенов.
Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.
При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.
(ИФА) - это способ исследования крови в лаборатории, основанный на поиске специальных клеток - антител к различным заболеваниям. Метод позволяет не только выявить возбудителя, но и установить, на какой стадии находится патологический процесс. Последнее очень важно для прогноза и дальнейшего лечения пациента.
Преимущества и недостатки метода
Среди всех современных методов диагностики ИФА является самым инновационным и технически точным. Его основными преимуществами являются:
- Способность поиска всех существующих антител к инфекционным заболеваниям в крови пациента.
- Высокая доступность метода исследования. На сегодняшний день анализы методом ИФА может выполнить любая лаборатория среднего масштаба.
- Практически 100% специфичность и чувствительность метода.
- Возможность поиска антител и антигенов, а также установление стадии патологического процесса и отслеживание его динамики, благодаря сравнению количества.
Такое количество преимуществ перед другими анализами полностью затмевает один-единственный недостаток анализа: он способен выявлять антитела, но не самого возбудителя.
Основные термины для оценки анализа
Для того чтобы разобраться в том, какой бывает ИФА-анализ, что это такое и как выполняется, нужно познакомиться с основными терминами, применяемыми специалистами.
- Антитело - белок, который вырабатывается клетками иммунной системы человека (лимфоциты типа В). Они отвечают специфической реакцией на попадание в организм чужеродного агента или вещества. Другое название антител - иммуноглобулины, они принадлежат к разным классам: A, E, M, G. Они отличаются друг от друга массой, скоростью реагирования, периодом полураспада и рядом других характеристик. В норме кровь человека содержит в основном иммуноглобулины класса G. Если происходит какое-либо инфицирование, то резко увеличивается количество иммуноглобулинов A и M. Иммуноглобулины E принимают участие в аллергических реакциях.
- Антиген - чужеродный агент, имеющий органическое происхождение и высокую молекулярную массу. Чаще всего представляет собой возбудителей или их биологически активные вещества.
- Комплекс "антиген-антитело", или иммунный комплекс, - это непосредственно комбинация чужеродного вещества и иммуноглобулина, дающая развитие иммунной реакции.
Суть и область применения метода
У пациентов зачастую возникает вопрос: ИФА-анализ, что это такое, как выполняется и для чего он нужен? Доступно о методе можно рассказать, описав вкратце его стадии.
Подготовительная стадия . Врач лаборатории использует специальный планшет, в котором 96 лунок. На поверхность каждой лунки нанесен антиген определенного возбудителя.
Стадия 1. Выполняется забор крови, которая затем по капле наносится на лунку. В лунке запускается реакция между антигеном и антителом в крови.
Стадия 2. В лунке полным ходом идет реакция с образованием иммунных комплексов. В результате образуется вещество определенного цвета. Интенсивность окраски зависит от количества антител в крови пациента к каждому конкретному возбудителю.
Стадия 3. Оценка результата путем фотометрии. Для этого применяется специальный прибор под названием "спектрофотометр". С его помощью сравнивается плотность материала в лунке и контрольного образца. Далее прибор путем математического анализа генерирует результат.
Оценка результатов и предназначение ИФА
Интерпретация результата зависит от нескольких важных нюансов:
- Оптической плотности лунки.
- Производителя пластины с лунками (тест-системы).
- Лаборатории, в которой выполнялось исследование.
Учитывая эти нюансы, никогда не следует сравнивать два результата с разных тест-систем или из разных лабораторий.
Еще одним немаловажным моментом, влияющим на анализ ИФА, является так называемая авидность антител. Этот параметр характеризует количество антигена, прочность связи в комплексе "антиген-антитело". В основе его определения лежит обработка иммуннокомплекса мочевиной с целью разрешения белковых структур. Это позволяет разрушить слабые связи между антигеном и антителом и оставить только прочные. Значение исследования на авидность заключается в том, что с его помощью можно узнать срок инфицирования. Эта информация чрезвычайно важна для постановки диагноза беременным женщинам.
Анализ крови методом ИФА служит:
- Для поиска различных антигенов возбудителей.
- Для исследования гормонального фона.
- Для обследования на наличие аутоиммунной патологии.
- Для обнаружения маркеров онкологических заболеваний.
Разновидности ИФА
Анализ ИФА имеет следующие разновидности:
- Непрямой.
- Прямой.
- Конкурентный.
- Метод блокирования.
Но на деле сегодня применяется только способ под названием ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). В его основе лежит вышеописанная реакция образования комплекса антигена с антителом с изменением окраски на поверхности лунки.
Отдельного внимания заслуживает непосредственно количественный ИФА-анализ крови. Это не разновидность анализа, а способ оценки результатов. Благодаря ему подсчитывается количество антител и определяются их классы. Результат зависит от оптической плотности пробы, тест-системы, на которой выполнялся анализ ИФА, а также от лаборатории.
Заболевания, выявляемые ИФА
ИФА - анализ крови, позволяющий выявить огромное количество различных инфекционных заболеваний. Притом с одинаковой точностью выявляются как вирусные, так и бактериальные заболевания. Например, с помощью образования иммуннокомплексов можно доказать наличие антигенов возбудителей следующих заболеваний:
Кроме того, ИФА позволяет обнаружить:
- Маркеры онкологических заболеваний - ФНО (фактор некроза опухоли), ПСА (простатспецифический антиген), РЭА (раково-эмбриональный антиген), СА-125 (маркер опухолей яичников)
- Гормон беременности — ХГЧ (хорионический гонадотропин).
- Нарушения репродуктивной системы: гормоны женской и мужской половой систем.
- Патологию щитовидной железы.
Важно упомянуть, что анализ ИФА на ВИЧ сегодня является главным способом диагностики этого опасного заболевания.
Материал для ИФА и техника забора
Для выполнения ИФА у пациента производится забор крови натощак. Далее из крови получают сыворотку, которая непосредственно используется для проведения анализа. Кроме того, ИФА можно проводить на спинномозговой жидкости (ликворе), слизи цервикального канала (шейки матки), околоплодных водах и даже жидкости стекловидного тела (глазного яблока).
Перед сдачей крови пациента предупреждают о том, что он не должен принимать никаких лекарственных препаратов, а лечение антибиотиками и противовирусными препаратами рекомендуется заканчивать не менее чем за две недели до забора крови.
Сроки получения и расшифровка результатов
Сроки получения ответа из лаборатории зависит не от скорости ее работы, а от того, на какой стадии находится заболевание и какие антитела уже появились в крови. Так, к примеру: иммуноглобулины М появляются примерно через 2 недели после взятия крови на анализ и означают, что процесс находится на стадии первичного инфицирования или произошло обострение хронического. Одновременно антитела классов M и G появляются при первичной инфекции. Притом последние могут обнаруживаться спустя 4 недели.
IgA появляются спустя 2-3 недели либо в одиночку, либо вместе с М, означая острую инфекцию, или вместе с G, указывая на хронический процесс.
Такие разные сроки появления антител в крови заставят пациента долго ожидать результата. Допустимо ожидание более месяца после того, как выполнен анализ ИФА. Расшифровка и интерпретация врачом также занимают определенный промежуток времени.
